根据病史、体征、放射线和心电图检查，再结合心导管检查和心血管造影，诊断室间隔缺损甚困难。然而确立诊断时，应与下列疾病鉴别。
1、肺动脉狭窄 室间隔小缺损，尤其位于室上嵴和肺动脉瓣之间或肺动脉干下者，很易与肺动脉狭窄混淆，特别是瓣膜型狭窄。但后者的震颤和杂音的部位较高，肺动脉瓣区第二心音减弱，放射线照片显示肺动脉狭窄后扩张和肺纹理减少。
2、动脉导管末闭 有两种情况不容易鉴别，一是高位窒间隔缺损合并主动脉瓣脱垂和关闭不全者，易与典型动脉导管未闭混淆。听诊前者为双相收缩期和舒张期杂音，后者为连续性杂音；前者X线示主动脉结不明显，后者主动脉结增大。二是动脉导管未闭伴有肺动脉高压，仅有收缩期震颤和杂音者，与高位室间隔缺损鉴别较为困难。前者脉压差较大，杂音位置较高，主动脉结显著。较可靠的方法是超声检查、升主动脉及左室造影。
3、继发孔型房间隔缺损 低位房间隔缺损，其杂音可位于胸骨左缘第2肋间，声音柔和像吹风样，传导局限，常伴肺动脉第二心音固定分裂。心电图示不完全右束支传导阻滞或右心室肥大，而无左心室肥大，额面QRS环多为顺钟向运行，主体部向右向下。V1导联常呈rsR'。多普勒超声心动图可明确诊断。
4、完全性心内膜垫缺损 症状较室间隔缺损严重且更早出现严重的肺动脉高压。在心尖部常可听到由于二尖瓣反流而引起的收缩期杂音。超声心动图检查可明确诊断。
5、法洛四联症 当患者肺动脉压力重度增高，出现艾森曼格综合征时，应与此类发绀型先天性心脏病相鉴别。
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